Representado por casi cincuenta obras, más de un tercio de su producción, Velázquez es el protagonista absoluto de este período en el Prado. Entre sus obras más apreciadas se pueden señalar La Adoración de los Reyes Magos, perteneciente a su fase sevillana. De su etapa como pintor de corte destacan los retratos de Felipe IV y del príncipe Baltasar Carlos y los del Infante don Carlos y La reina doña Mariana de Austria; junto con una amplia colección de bufones como Pablo de Valladolid. A los años en que Velázquez estuvo al servicio de Felipe IV corresponden también algunas pinturas "de historia" como Los Borrachos, La fragua de Vulcano y La Rendición de Breda, a las que se suman las dos grandes composiciones que realizó al final de su vida, Las Hilanderas y Las Meninas.

De los otros grandes pintores del Siglo de Oro –Ribera, Murillo, Zurbarán y Alonso Cano- el Museo posee obras memorables. Como Velázquez, también Ribera está representado por medio centenar de pinturas, entre las que se incluyen algunas de sus obras maestras Esau y Jacob o El Martirio de San Felipe. De Murillo se guardan en el Prado cerca de cuarenta cuadros, algunos tan conocidos como El Buen Pastor, La Sagrada Familia del pajarito o La Inmaculada de Soult. De Zurbarán también existe una colección importante entre la que destacan Santa Isabel de Portugal y los dos cuadros de la historia de san Pedro Nolasco, procedentes del claustro de la Merced de Sevilla, y lo mismo sucede con Alonso Cano, con obras como el Cristo muerto sostenido por un ángel.

El Prado cuenta con numerosas obras religiosas de la escuela madrileña de Fray Juan Ricci, Pereda, Francisco de Herrera el Mozo y Claudio Coello, así como magníficos retratos de Carreño de Miranda. Tampoco faltan representaciones de otras escuelas como la sevillana en la que destaca Valdés Leal.