En pintura románica hay que señalar por su excepcional importancia los frescos de San Baudelio de Berlanga y de la Vera Cruz de Maderuelo, éstos últimos instalados en una capilla hecha a propósito en el Museo para reproducir la disposición original de las pinturas.

La pintura francogótica tiene un digno ejemplar en el Retablo de San Cristóbal, el estilo ítalo-gótico en los Retablos de san Juan Bautista y de la Magdalena de Jaime Serra y el estilo internacional en el Retablo de la Vida de la Virgen y de San Francisco de Nicolás Francés.

De la pintura hispanoflamenca el Prado posee una de las obras maestras de Bartolomé Bermejo, el Santo Domingo de Silos, y dos piezas capitales de Fernando Gallego, el pintor más conocido de los que trabajaron entonces en Castilla, La Piedad con donantes y el Cristo bendiciendo. De Juan de Flandes, el pintor de corte de Isabel la Católica, cabe destacar la importante Crucifixión, adquirida el año 2005, uno de sus mayores logros.

Los inicios del Renacimiento están representados en el Museo por la serie de pinturas de Pedro Berruguete procedentes de Santo Tomás de Ávila, entre las que destaca el Auto de Fe presidido por Santo Domingo de Guzmán, la Virgen del caballero de Montesa de Pablo de San Leocadio y la Flagelación de Alejo Fernández.