Después de la escuela española, por calidad y cantidad, se sitúa la italiana, con más de mil cuadros, muchos de ellos procedentes de la Colección Real.

De la pintura de los siglos XIV y XV, menos valorada hasta el siglo XIX, hubo muy pocas obras en la Colección Real. Precisamente por ello, también está mucho menos representada en el Museo, aunque cuenta con algunas obras maestras del siglo XV de Fra Angelico, Mantegna, Antonello de Messina y Botticelli, que ingresaron en el Prado de forma diversa.

La pintura del siglo XVI conforma un conjunto más coherente y completo, que en su mayoría proviene de la Colección Real. De todas las escuelas la mejor representada es la veneciana. Las obras realizadas para Carlos V y Felipe II convirtieron a Tiziano en el artista distintivo de los Habsburgo. Sólo de él se conservan más de cuarenta cuadros en el Prado. Y también se guardan piezas excepcionales de Veronés, Tintoretto o los Bassano. El extraordinario grupo de obras de Rafael adquiridas por Felipe IV inició el nuevo gusto por el pintor de Urbino, que con los Borbones desplazó a Tiziano como pintor emblemático. También están representados en el Prado otros grandes maestros como Correggio y Parmigianino de la escuela de Parma, Sebastiano del Piombo de la de Roma o Andrea del Sarto de la de Florencia.

El conjunto de pinturas del siglo XVII y XVIII italiano es también uno de los más extensos del Museo del Prado, y de nuevo las colecciones reales tienen el mayor protagonismo. Muchas pinturas llegaron gracias a la gestión de los embajadores y virreyes españoles en Roma y Nápoles para decorar el Palacio del Buen Retiro, construido en el siglo XVII. Otro grupo importante se debe a la presencia en España de artistas italianos como Luca Giordano, Corrado Giaquinto o Giambattista Tiepolo.