Durante su encuentro en Augsburgo en 1550-51, Carlos V encargó a Tiziano La Gloria, finalizada en octubre de 1554, cuando fue enviada a Bruselas. La inusual composición, que debió atenerse a precisas instrucciones del emperador como ya apuntara Gronau, está presidida por la Trinidad, a cuya derecha figuran los dos intercesores por excelencia: la Virgen y tras ella San Juan Bautista. La prelación de la Virgen sobre los demás personajes se manifiesta compositivamente y cromáticamente, al ser la única figura que camina hacia la Trinidad y no la contempla expectante, y vestir con el mismo azul que el Padre y el Hijo. Por debajo de ella se reconocen por sus atributos personajes del Antiguo Testamento como Adán y Eva, Noé, Moisés, David o Ezequiel, mientras la figura femenina de espaldas en primer plano se ha identificado con la Sibila Eritrea, María Magdalena e incluso la Iglesia católica. A la izquierda de la Trinidad, derecha del espectador, ángeles con palmas acompañan a miembros de la familia imperial envueltos en sudarios, descalzos y en actitud suplicante: Carlos con la corona imperial junto a su fallecida esposa Isabel, y atrás y ligeramente más abajo, sus hijos Felipe y Juana y sus hermanas Leonor y María. En un nivel inferior aparecen dos ancianos barbados identificados con Pietro Aretino y el propio Tiziano de perfil. También Francisco de Vargas, embajador de Venecia, hizo incluir su retrato, y probablemente sea el personaje barbado bajo la Virgen. El plano terrenal lo ocupa un paisaje bucólico donde tiene lugar una escena que Harbison identificó erróneamente con el martirio de San Pedro de Verona. Sin embargo, a tenor de sus cayados las diminutas figuras a la izquierda son peregrinos sorprendidos ante el grandioso espectáculo que tiene lugar en sus cabezas. Pese a su reducido tamaño estos personajes poseen gran importancia como fedatarios de cuanto acontece, estableciéndose una conexión entre el plano terrenal y el celestial ausente en las obras de Lorenzo Lotto o Alberto Durero señaladas como precedentes de La Gloria.

El significado de la pintura es confuso. Aretino, Vasari y el inventario de Carlos V aluden a La Trinidad, pero en el codicilo del testamento del emperador se denomina Juicio Final. Sigüenza le da este último título al narrar la muerte de Carlos V en Yuste, y La Gloria al referir su traslado al Escorial. De ello se infiere que estamos ante una obra susceptible de varias lecturas que, si en inicio pudo tener un valor dogmático como plasmación visual de la ortodoxia trinitaria de los Austrias, adquirió un carácter devocional cuando Carlos pidió contemplarla antes de morir, lo que explicaría su designación como Juicio Final pese a no serlo. En realidad se trataría del juicio particular de Carlos, como advirtió el inquisidor de Venecia Valerio Faenzi al afirmar que mostraba la esperanza de salvación eterna del emperador, cuando autorizó en 1567 la publicación de una estampa de Cornelis Cort. El cuadro admite incluso una lectura política. Resulta significativo junto a qué familiares quiso presentarse Carlos ante la Trinidad, destacando las ausencias de su hermano Fernando y su sobrino Maximiliano como consecuencia de la crisis desencadenada por la sucesión imperial entre Fernando y Felipe en la reunión de Augsburgo de 1550-51, cuando se encargó la pintura.

La fuente textual es un pasaje del último libro de De Civitate Dei de San Agustín que narra la visión celeste de los bienaventurados, visualizado con relativa frecuencia por artistas nórdicos y de cuya vigencia en la corte imperial da fe la glosa que le dedicó fray Luis de Granada en la Segunda parte de la Guía de pecadores (Lisboa, 1556).

El sentido ascendente de la composición, de la tierra al cielo, tiene su correlato en la técnica empleada. A medida que nos elevamos, las figuras se diluyen y la pintura aligera su empaste, dejando visible la preparación del lienzo. Independientemente de estos efectos, la calidad de la obra es desigual. Junto a figuras espléndidas como David o Moisés, que merecen figurar por su monumentalidad entre las mejores de su autor, otras delatan el concurso de ayudantes, más evidente en la zona media y superior de la composición. Especialmente desafortunados son los retratos de la familia imperial, y entre éstos el de la emperatriz. Pero incluso en figuras en primer plano debidas sin discusión a Tiziano afloran problemas. Tal es el caso de Noé, cuya lógica anatómica fue sacrificada en aras de una mayor claridad expositiva. A fin de separar los cuerpos de Noé y Moisés, Tiziano introdujo entre ambos una pincelada de azul cielo, claramente aplicada sobre la espalda ya pintada del primero, que queda así reducida a unas dimensiones impropias para su tamaño. Ese interés por definir planos explica el marcado silueteado de la figura femenina en primer término, lo que unido al tono verde de su atuendo la aproxima extraordinariamente a Santa Margarita.

Esta obra permaneció en el Aula de Moral del Escorial desde al menos 1566 y hasta su ingreso en el Museo del Prado en 1837.