Dada la importancia del cuadro se consideró necesario, antes de abordar su restauración, convocar un Simposio Internacional en el que expertos de todo el mundo contaran su experiencia en las restauraciones de las obras de Tiziano y dieran su opinión sobre los criterios con los que afrontar la de Carlos V en Mühlberg. Así, en marzo de 2000 se inició la restauración del cuadro y en 2001 estuvo finalizada

Respetuosos a los principios de conservación del Museo Nacional del Prado, la finalidad de la restauración era equilibrar y serenar todos los daños sufridos por la pintura y lograr así un principio unitario en la lectura del cuadro respetando su íntima esencia no sólo en la superficie pictórica sino también en su estructura material. La restauración recuperó en buena medida sus calidades originales, a la vez que ha permitido estudiar con detalle el proceso de creación de la obra.