El Museo del Prado cuenta con una de las obras maestras del Renacimiento pleno, Santa Catalina de Fernando Yáñez, y una de las pinturas más conocidas de Juan de Juanes, La Última Cena. Otros pintores bien representados en el Museo son el toledano Juan Correa de Vivar y el extremeño Luis de Morales, particularmente con sus Vírgenes con el Niño. Digna de destacar es la serie de retratos de Corte con obras de Alonso Sánchez Coello y de Juan Pantoja de la Cruz.

Sin duda, el pintor más importante de esta colección es El Greco. El Prado posee dos obras realizadas en Italia, La Anunciación y La Huida a Egipto, y más de treinta ejecutadas en España. De entre estas últimas cabe destacar La Trinidad del retablo de Santo Domingo el Antiguo de Toledo, una de las primeras obras que el cretense llevó a cabo al instalarse en esta ciudad, los cinco grandes lienzos del Retablo del Colegio de Doña María de Aragón y el famoso Caballero de la mano en el pecho, junto con un admirable grupo de retratos.

Entre las obras del primer naturalismo son ejemplos de primer orden las pinturas de Ribalta, Maíno y Herrera el Viejo que posee el Prado. A este momento pertenecen algunos destacados bodegones, entre ellos el de Caza, hortalizas y frutas de Sánchez Cotán y la serie de Juan van der Hamen, enriquecida en el año 2006, gracias a la adquisición de la colección Naseiro.