Dieses Porträt von Kaiser Karl V. (1500-1558) zu Pferde entstand im Gedenken an den Sieg der kaiserlichen Truppen über die Protestanten bei Mühlberg. Die scheinbare Schlichtheit der Komposition birgt eine vielschichtige Symbolik, die Karl V. in seiner Eigenschaft als christlicher Ritter und Erbe der römischen Kaisertradition zeigt. Ein Beispiel hierfür ist die Lanze, die der Kaiser in seiner rechten Hand hält und die nicht nur ein Machtsymbol der Cäsaren war, sondern auch auf die Waffe des Heiligen Georg und die Lanze des Longinus während der Passion Christi anspielt (Longinus war ein römischer Soldat, der seine Lanze in den Leib Christi stieß und später zum Christentum übertrat.).

Als formale Vorläufer der Komposition werden die Darstellungen der Reiterstatue von Kaiser Mark Aurel (121-180) in verschiedenen Stichen Albrecht Dürers, wie „Ritter, Tod und Teufel“, sowie Werke von Hans Burgkmair genannt.

Die kaiserliche Rüstung ist Teil der Waffensammlung des Madrider Königspalastes.

Das Werk wurde für Maria von Ungarn geschaffen und geriet zum dynastischen Innbild schlechthin des österreichischen Königshauses. Im Jahr 1827 wurde es in die Sammlung des Prado-Museums aufgenommen.