El edificio que hoy sirve de sede al Museo Nacional del Prado fue diseñado por el arquitecto Juan de Villanueva en 1785, como Gabinete de Ciencias Naturales, por orden de Carlos III. No obstante, el destino final de esta construcción no estaría claro hasta que su nieto Fernando VII, impulsado por su esposa la reina María Isabel de Braganza, tomó la decisión de destinar este edificio a la creación de un Real Museo de Pinturas y Esculturas. El Real Museo, que pasaría pronto a denominarse Museo Nacional de Pintura y Escultura y posteriormente Museo Nacional del Prado, abrió por primera vez al público en 1819. El primer catálogo constaba de 311 pinturas, aunque para entonces en el Museo se guardaban ya 1510 obras procedentes de los Reales Sitios. Las valiosísimas
Colecciones Reales, germen de la colección del actual Museo del Prado, comenzaron a tomar forma en el siglo XVI bajo los auspicios del emperador Carlos V y fueron sucesivamente enriquecidas por todos los monarcas que le sucedieron, tanto Austrias como Borbones. A ellos se deben los tesoros más emblemáticos que se pueden contemplar hoy en el Prado, tales como El jardín de las Delicias de El Bosco, El caballero de la mano en el pecho de El Greco, El tránsito de la Virgen de Mantegna, La Sagrada Familia conocida como La Perla de Rafael, Carlos V en Mülhberg de Tiziano, El Lavatorio de Tintoretto, el Autorretrato de Durero, Las Meninas de Velázquez, Las tres Gracias de Rubens o La familia de Carlos IV de Goya.

Del Museo de la Trinidad llegaron importantes pinturas como La Fuente de la Gracia de la Escuela de Jan Van Eyck, Auto de fe presidido por santo Domingo de Guzmán de Pedro Berruguete y los cinco lienzos procedentes del Colegio de doña María de Aragón de El Greco. Del Museo de Arte Moderno proceden gran parte de los fondos del siglo XIX, obras de los Madrazo, Vicente López, Carlos de Haes, Rosales y Sorolla.
Desde la fundación del Museo han ingresado más de dos mil trescientas pinturas y gran cantidad de esculturas, estampas, dibujos y piezas de artes decorativas por Nuevas Adquisiciones, en su mayoría donaciones, legados y compras. Las  Pinturas Negras de Goya llegaron al Museo gracias a la donación del Barón Emile d’Erlanger en el siglo XIX. Compras muy interesantes en los últimos años han sido Fábula y Huída a Egipto de El Greco, en 1993 y 2001, La condesa de Chinchón de Goya en el 2000 y El barbero del Papa de Velázquez en el 2003. Numerosos legados han enriquecido los fondos del Museo, tales como el Legado de don Pablo Bosch con su magnífica  colección de medallas, el Legado de don Pedro Fernández Durán, con su amplísima colección de dibujos y artes decorativas, y el Legado de don Ramón de Errazu con pintura del siglo XIX.

Tanto la colección como el número de visitantes del Prado se han incrementado enormemente a lo largo de los siglos XIX y XX, por lo que el Museo ha tenido que ir acometiendo sucesivas ampliaciones en su sede histórica hasta agotar totalmente las posibilidades de intervención sobre este edificio. Por este motivo, el Prado se ha visto obligado a buscar el camino de su actual ampliación mediante una solución arquitectónica de nueva fábrica situada junto a la fachada posterior de su sede tradicional y conectada con ésta desde el interior.

Paralelamente a la ejecución de su último y más ambicioso proyecto de ampliación (2001-2007), el Prado ha iniciado una etapa de modernización cuyo definitivo impulso tuvo lugar en 2004 al aprobarse un cambio de régimen jurídico y estatutario basado en la necesidad de flexibilizar la gestión del Museo, agilizar su funcionamiento e incrementar su capacidad de autofinanciación. Este cambio de estatus se hizo efectivo a través de la Ley reguladora del Museo Nacional del Prado aprobada en noviembre de 2003, como primer paso, así como en el posterior desarrollo de la misma a través de un Estatuto sancionado por Real Decreto de 12 de marzo de 2004.