A partir de la década de los ochenta, el Greco elaboró una interesante iconografía en torno al tema de la Sagrada Familia que continuó trabajando en los años siguientes y del que realizó varias versiones (Hispanic Society de Nueva York, Museo de Santa Cruz de Toledo, National Gallery of Art de Washington). La versión del Prado nos muestra una María de cuerpo entero y sentada, centrando la composición. Es una joven de rostro ensimismado, cubierta por el característico manto azul; sostiene en su regazo al Niño mientras acoge bajo su brazo derecho a Santa Ana, tocada ésta con un velo blanco y rizado. La santa se inclina hacia el Niño, y a diferencia de otras versiones en las que aparece dormido, aquí éste le devuelve la mirada. La madre de la Virgen se dispone a envolver al pequeño con un paño blanco que sostiene con ambas manos. Al otro lado, emergiendo tímidamente tras la Virgen, San José observa la escena. El Greco lo ha representado como un hombre maduro, no anciano, un santo activo y vigoroso que viste chaleco verde sobre camisa blanca y capa ocre-amarillenta, una ropa propia de un trabajador artesano castellano de la España de finales del siglo XVI, que cuadraba bien con el filius fabri que algunos textos de la época proyectaron del santo.

Delante de éste y próximo a la Virgen, el pequeño San Juan se convierte en un acompañante un tanto más desligado de la escena, y no sólo por dirigir su mirada a un punto inconcreto fuera del cuadro, también el tratamiento pictórico que le ha otorgado el artista le convierte en una figura desdibujada y de una escala reducida en relación con el resto de las figuras. Está desnudo, a pesar de que se insinúa la tradicional piel de camello a su espalda, y lleva consigo un cuenco de vidrio con fruta; el índice izquierdo próximo a la boca parece reclamar silencio. Todo el grupo está constreñido en un estrecho espacio culminado por celajes que se ciernen sobre las cabezas de los personajes (Texto extractado de Ruiz, L.: El Greco en el Museo Nacional del Prado. Catálogo razonado, Museo Nacional del Prado, 2007, pp. 115-119).