Hacia 1522, el banquero florentino Lorenzo di Bernardo Jacopi Jacorsa encargó esta obra, también conocida como Madonna della Scala, al artista florentino. El tema del cuadro no es de fácil interpretación y nunca hubo acuerdo sobre su significado. La Virgen y el Niño ocupan el centro de la representación. A la derecha hay un ángel con un libro en las manos y al fondo una ciudad fortificada en la falda de una montaña. A la izquierda, tras el hombre sentado, descrito a veces como san Mateo, otras como San José, e incluso como san Juan Evangelista, una mujer lleva a un niño de la mano, actualmente identificados como santa Isabel y san Juan Bautista huyendo de la Matanza de los Inocentes.

Que fue un encargo importante lo demuestran los numerosos dibujos preparatorios conservados y el complejo trabajo subyacente puesto al descubierto por el infrarrojo. La ordenada superficie visible oculta singulares e interesantes transformaciones que nos hablan tanto de las dudas del pintor a la hora de representar a la Virgen y al Niño -dudas que han creado un complejo entramado de líneas bajo ellos-, como de un cambio iconográfico en el que la supresión de elementos en el fondo y en la figura del ángel alteró la escenografía del episodio evangélico, matizando el significado de la obra.

Uno de los datos más importantes que ha revelado el estudio con reflectografía infrarroja es la existencia, bajo la imagen de superficie, de dos representaciones diferentes de la Virgen y el Niño solapadas. Y no sólo encontramos estas figuras subyacentes, sino que además se ve cómo Sarto rectificó, a veces insistentemente, la posición de los brazos, las manos y la caída de los pliegues.

La transformación del ángel plantea algunos interrogantes. En el dibujo subyacente se giraba hacia las dos figuras centrales, dando más la espalda al espectador. El diseño de sus alas era muy diferente y sujetaba un cordero en las manos en lugar del libro.

Andrea suprimió en el fondo una serie de elementos que había dibujado inicialmente, cambiando el simbolismo y precisando la iconografía del cuadro, concediendo así una mayor presencia al grupo principal. En el documento de infrarrojos se ve cómo unas líneas -incisas y dibujadas- continúan paralelas a los escalones pintados, definiendo más peldaños, y llegan hasta una balaustrada rematada por una escultura sobre un pedestal; en éste se apoya un personaje rodeado por otras figuras, tras las cuales se elevan las trazas de un muro. Esta primera escenografía dibujada hace pensar que la Virgen, originalmente, estaba sentada a los pies de la escalera de un templo.

Respecto al paisaje del último plano, en la imagen de la reflectografía infrarroja podemos ver, en la parte derecha, que la montaña era más alta y a sus pies el pintor había esbozado un bosque con aguada, ahora cubierto por la ciudad pintada, en un principio dibujada en lo alto de la colina. Sólo en la imagen del infrarrojo y en la radiografía se ven, detrás de la Virgen, las siluetas de dos troncos, que Sarto también llegó a pintar. El final de estos troncos señala el límite que tenía la primera representación de la Virgen y es muy posible que los introdujera en el momento del segundo cambio, antes de modificar su postura.

La escena podría reflejar el episodio narrado en el Evangelio apócrifo del pseudo-Mateo en el que la Virgen y el Niño, en su huida a Egipto, entran a buscar hospedaje en Sotinen, ciudad de los confines de Hermópolis y, al no encontrar posada, se paran a descansar a la entrada del Capitolio de Egipto -"Templum ingressi sunt"- lugar donde se adoraba a 365 ídolos, quizás simbolizados por la escultura dibujada a la izquierda, mientras que las figuras situadas a su lado serían los sacerdotes del templo. Si se mantiene la identificación de la mujer y el niño que huyen con Isabel y el Bautista -episodio narrado en el Protoevangelio de Santiago- se enlazaría con el episodio de la Matanza de los Inocentes, relato que, por otra parte, sólo se encuentra en el Evangelio de Mateo, figura masculina de la izquierda. La figura alada mostraba un cordero a Jesús, anunciándole su Pasión.

Considerando que la obra fue el encargo de un banquero, cuyo patrón es san Mateo, se entendería que el cambio del escenario obedeciera a un deseo del cliente. El pintor, para hacer una referencia más clara al patronazgo y para suavizar la "dureza" del relato de los Inocentes, convirtió el fondo en un paisaje abierto, y sustituyó el cordero que sostiene el ángel por un libro, con lo que cobraba mayor importancia la faceta de Mateo sólo como escritor, más atractiva que la del evangelista que reflejó el lado más humano de Cristo e hizo la descripción más dramática de su Pasión.