Este retrato muestra a la reina Isabel de Valois, tercera esposa de Felipe II, de cuerpo entero. Viste una saya negra con mangas de punta, cuya larga cola trasera se enrolla sobre su figura y sobresale por detrás. De las mangas, sujetas con botones de rubíes y diamantes, asoman las manguillas en plata y oro y, a su vez, las mangas van forradas internamente por una tela blanca. La saya entera va guarnecida con aplicaciones de terciopelo con diferentes texturas y tonalidades de negro y se abrocha en la parte frontal por alamares de perlas que, a la muerte de la reina, se dieron a su camarera mayor, la III duquesa de Alba. Va tocada con multitud de joyas que se entrelazaban con sus cabellos, tal como se peinaba prácticamente a diario, según informan las relaciones. También luce un collar y una cintura de diamantes y perlas.

La reina sostiene una miniatura de su marido, como las que desde poco después de su llegada a la corte española encargó a Alonso Sánchez Coello (h. 1531-1588), por ejemplo, una sobre una chapa de plata que se envió a Francia. En ocasiones, estas miniaturas se guarnecían con labores en oro y esmaltes de colores, a modo de marco de orfebrería, como el ejemplar que tiene la francesa en su mano. El rey viste una ropilla negra ornada con botones y lleva el toisón al cuello colgado de una cinta de seda roja, en una imagen similar a los retratos del período como rey de Inglaterra. La aparición de la miniatura de su marido vestido de corte se ha querido asociar al papel de la reina en la Conferencia de Bayona, celebrada en junio de 1565, en la que Isabel se entrevistó en nombre de Felipe II con su madre Catalina de Médicis y su hermano Carlos IX, rey de Francia. Sofonisba ya había efigiado a la reina en 1561 y esa obra, que podría haber sido similar al busto conservado hoy en Viena y firmado en su etapa genovesa, se consideraba el mejor de todos sus retratos.

Junto a la joven se yergue una columna de jaspes polícromos que es característica de estos retratos de Estado y que hace alusión al linaje de su marido. También parece que detrás de la reina pudo haber una ventana, otro recurso de los retratos para evocar los interiores palaciegos. En los laterales del cuadro aún se percibe el marco de madera con molduras trompe l’oleil que lo emparejaban con el retrato de Felipe II en la jornada de San Quintín realizado por Antonio Moro (h. 1516-1576) en 1557, trasladado en 1600 a Valladolid y actualmente perdido.

Hasta fecha reciente este retrato se atribuyó a Sánchez Coello. Sin embargo, detalles como la preparación en blanco de plomo han hecho que su autoría se incline hacia la pintora de Cremona. También las radiografías muestran arrepentimientos en la posición del retrato de Felipe II o en la base de la columna. Así mismo, pudo haber un cortinaje detrás.

A la muerte del rey en 1598, el cuadro se describió en el Guardajoyas del Alcázar madrileño, protegido por una cortina de tafetán azul, como era común en muchos cuadros de la colección real. Cuando Felipe III trasladó la corte a Valladolid, se colgó en el lienzo norte de la galería sobre el jardín en el Palacio Real de esa ciudad. En junio de 1606 Bartolomé Carducho (1560-1608) lo atribuyó a Sánchez Coello. En 1636 fue seleccionado para decorar el Palacio del Buen Retiro. Allí se puede seguir su presencia hasta después de la muerte de Carlos III y el número blanco que presenta en su ángulo inferior izquierdo corresponde al inventario de 1794. Entonces aún parece que conservaba el marco entero de madera fingida que posteriormente se recortó por arriba y por abajo, quizá cuando se restauró ya en el siglo XIX. Ingresó en 1857 en el Museo Real de Pinturas.

Pérez de Tudela, Almudena, 'Atribuido a Sofonisba Anguissola. Isabel de Valois sosteniendo un retrato de Felipe II' En:. Historia de dos pintoras: Sofonisba Anguissola y Lavinia Fontana., Madrid, Museo Nacional del Prado,, 2019, p.140-142 nº. 24