La Sagrada Familia, llamada "La Perla" representa a la Virgen María, el Niño, san Juanito y santa Ana. El Niño se sienta entre las rodillas de su madre, a quien mira sonriendo de medio perfil, y apoya el pie izquierdo sobre una cuna de mimbre. San Juanito se coloca de pie frente al Niño y le ofrece unas frutas dentro de su pelliza, mientras la Virgen contempla la escena con expresión dulce. Santa Ana, arrodillada detrás del Niño, mantiene una actitud de meditación, con los ojos cerrados, arropada por el abrazo de su hija. Al fondo, en el lado derecho, se abre un paisaje con edificios en ruinas, un puente sobre un río y pequeñas figuras, mientras que a la izquierda, tras el vano de una ventana, aparece san José. En primer plano, vegetación, piedras y una concha marina.

Se trata de una obra tardía del artista en la que es patente la influencia de Leonardo tras su reencuentro en Roma entre 1513 y 1516, especialmente evidente en la disposición piramidal de las figuras y los contrastes lumínicos. Atendiendo a estas características de estilo, la fecha generalmente aceptada para su creación se situaría en torno a 1518.

El dibujo subyacente es muy abundante y de trazos bien definidos. En la zona inferior y central, donde se coloca el grupo de figuras, se observa una cuadrícula que delimita espacios de unos 11 cm de lado, medida que, curiosamente, coincide con el óvalo de la cara de la Virgen. Esto parece indicar que el módulo elegido para ejecutar el traspaso a escala fue, precisamente, este rostro, el único que no aparece atravesado por las líneas de la cuadrícula. La existencia de esta cuadrícula señala que la composición actual se basa en un dibujo previo que no se conserva. Es posible que no fuera completo, sino que sólo contuviera el grupo central.

En la composición final encontramos numerosos cambios respecto al dibujo preparatorio. La pintura que contemplamos en la actualidad sigue a grandes rasgos los contornos y características del dibujo, pero es fácil detectar varios detalles que han sido corregidos o incluso modificaciones importantes. La radiografía de la obra nos muestra la existencia de una primera versión de la composición por debajo de la actual, que coincide mucho más con el dibujo que observamos mediante reflectografía. De este modo, podemos hablar de dos fases en la ejecución pictórica; una primera, muy fiel al dibujo preparatorio, y una posterior que cambia sustancialmente la apariencia de la obra. Las modificaciones que se realizaron en la segunda fase iban encaminadas a dotar de una apariencia diferente a la obra, restándole serenidad para crear mayor tensión: la cabeza de la Virgen se hace más afilada, las de los niños se llenan de rizos, los pliegues se complican y las luces y sombras se intensifican. También cambia el paisaje; en la radiografía se observa que en el lateral derecho se abría un vano, y en general resultaba más luminoso.

La participación de Rafael y/o su taller en cada una de las fases es imposible de discernir con seguridad, aunque parece claro que el dibujo sí pertenece al maestro. La primera ejecución en pintura resulta más clásica y similar a lo hecho por él anteriormente, mientras que la segunda se acerca a la estética que posteriormente se desarrollará en el ámbito artístico italiano.

Según Vasari, fue pintada para el conde Ludovico Canossa, obispo de Bayeux. En 1604, su descendiente Galeazzo Canossa la cede a Vincenzo Gonzaga, duque de Mantua, y en 1627 es comprada por Carlos I de Inglaterra junto con otras obras de la familia. Tras la decapitación del rey inglés, pasa a manos de uno de sus acreedores, Edward Bass, a quien se la compra Alonso de Cárdenas en nombre de don Luis de Haro. Éste se la regala al rey Felipe IV quien, según la tradición, al verla exclamó "¡He aquí la perla de mis cuadros!", lo que justificaría el sobrenombre de "La Perla" con que es citada en varios inventarios desde entonces. El rey la envía a El Escorial, donde permanece hasta poco antes de su traslado por las tropas francesas a París en 1813. Es devuelta en 1818 al monasterio y en 1857 ingresa en el Museo del Prado.