Moro hizo este retrato durante su segundo viaje a España entre 1559 y 1561, cuando doña Juana (1535-1573) ya no era regente. Fue un encargo personal y permaneció en sus manos hasta su muerte. La pose y los atributos, como la silla, símbolo del poder, acentúan la majestad que se desprende de la princesa, dotada de una gran firmeza y capacidad para gobernar, tanta que algunos que la conocieron siendo regente aludieron al carácter varonil de su voluntad. El pintor la muestra de cuerpo entero a escala natural y en posición de tres cuartos, de pie, sujetando el pañuelo y los guantes en la mano izquierda y con la derecha apoyada en el sillón, dispuesto en un plano oblicuo para aumentar la profundidad. Lleva el cabello recogido por un tocado blanco como la alta lechuguilla, acorde con la moda de la época. Ante un fondo oscuro, a base de ocres y grises, que resalta la sensación de aislamiento y de distancia, con gran economía de medios -aunque sin renunciar a la técnica minuciosa que caracteriza sus retratos-, el pintor crea un espacio en el que se destaca el volumen de la princesa, iluminada desde la izquierda. El traje de tafetán de seda negra adecuado a su condición de viuda, le otorga una sensación de majestad. La figura de oro colgada de la manteleta blanca que cubre sus hombros, supuestamente Hércules con la clava, mítico antepasado de la monarquía hispana, se convierte en un atributo dinástico.

Hija de Carlos V, doña Juana de Austria se desposó en 1553 con don Juan Manuel, príncipe de Portugal, que falleció en enero de 1554, días antes de que Juana diera a luz a su hijo don Sebastián, rey de Portugal entre 1568 y 1578. Pocos meses después, sus deberes dinásticos le obligaron a abandonar Portugal sin su hijo para ejercer la regencia de España entre 1554 y 1559, primero en nombre de su padre y después en el de su hermano Felipe II. De fuertes convicciones religiosas, en 1554 ingresó en la Compañía de Jesús bajo el pseudónimo de Mateo Sánchez y en 1559 fundó el convento de las Descalzas Reales de Madrid donde residió y descansan sus restos (Texto extractado de Silva, P. en: El retrato del Renacimiento, Museo Nacional del Prado, 2008, p. 440).