La pintura visualiza con fidelidad el Génesis 30, 9-19, que responsabiliza a Eva de coger el fruto prohibido (aunque no especifica cuál, Tiziano siguió la tradición de la manzana), y cita un segundo árbol: una higuera, de cuyas hojas se sirvieron Adán y Eva para cubrirse los genitales. Aunque no hay certeza sobre la datación de la pintura o la identidad de su primer propietario, suele identificarse con el quadro grande de Adán y Eva de mano de Tiçiano inventariado el 21 de mayo de 1558 entre los bienes de Antonio Pérez. Respecto a la cronología, consta que Tiziano pintó para Gonzalo Pérez, padre de Antonio, desde la década de 1530, y que éste todavía recibió obras suyas en 1573. La crítica suele fechar esta pintura a inicios de la década de 1550, lo que parece compatible con el modelado aún definido de las figuras y la utilización de la escultura del Galo moribundo para Adán, al coincidir con la época de mayor impacto de este grupo helenístico en Tiziano, como se aprecia en el perdido Tántalo o Moisés de La Gloria. Se han invocado otras fuentes, como el fresco de igual tema de Rafael en la Estancia de la Signatura, de donde procede la representación de Adán sentado y Eva de pie, la Dyrse del grupo escultórico del Toro Farnese, del que derivaría el modo como Eva coge la manzana, y el grabado de Durero de 1504, citado también en relación a Eva y al énfasis en los elementos iconográficos; aunque Tiziano los limitó al zorro, tradicionalmente asociado al diablo, y al niño-serpiente que ofrece tentador la manzana. Otros aspectos de la obra enlazan con obras anteriores de su autor, como sombrear el rostro de un personaje, en este caso Eva, para subrayar el dramatismo de una acción, recurso que venía utilizando desde los frescos de Padua de 1511, por ejemplo en la Lucrecia de Hampton Court.

La radiografía descubre importantes cambios. Adán aparece más erguido, con el tronco más ladeado, la pierna derecha más próxima a la izquierda y el brazo derecho menos angulado. También Eva mostraba una ligera inclinación, perceptible sobre todo en el rostro y la cadera, y su brazo adelantado estaba más bajo. El cambio del brazo fue consecuencia de la inclusión del niño-serpiente. Inicialmente Eva cogía la manzana por sí misma de una rama más baja; pero Tiziano prefirió mostrar que su acción fue consecuencia de la tentación y no de su iniciativa, e incluyó al niño-serpiente ofreciéndosela ligeramente más arriba. El cambio de postura y posición del brazo fue resuelto sin embargo de forma poco afortunada. Probablemente para no ocultar al espectador la manzana, cuya ingesta desencadenó el drama posterior, Eva hace un movimiento poco natural y gira la mano para coger por detrás la fruta, pero sin que ese giro de la muñeca sea acompañado del correlativo del antebrazo. Para la cola bífida del niño serpiente, Tiziano reutilizó lo que anteriormente eran dos ramas.

La pintura produce una sensación contradictoria. La brillantez del color, especialmente atractivo en el paisaje, contrasta con cierta torpeza en el tratamiento de las figuras, perceptible en el comentado gesto de Eva y en la alambicada anatomía de Adán, cuya excesiva fidelidad al modelo escultórico obligó a incluir unas hojas de higuera para cubrir sus atributos que afean el conjunto. Consciente de tal deficiencia, Rubens, al copiar esta obra, modificó la figura de Adán y lo mostró más ladeado (P1692), en una posición más cercana a la revelada en la radiografía. Merced a esta y a otras modificaciones menores, Adán y Eva es la única copia de cuantas Rubens realizara de obras de Tiziano que supera al original.

Como en otras pinturas de Antonio Pérez, ésta pasó en 1585 a poder de Felipe II, a cuya muerte colgaba en la sacristía del Alcázar de Madrid, edificio que no abandonó hasta el incendio de 1734 y donde Rubens lo copió durante su segunda estancia en España entre 1628 y 1629. La pintura sí mudo de localización dentro del Alcázar. El cambio de mentalidad operado en el siglo XVII propició su traslado, poco antes de 1636, de un recinto sacro (sacristía) a otro profano: las llamadas bóvedas de Tiziano, que reunían los mejores desnudos de la colección real, donde permaneció hasta el incendió de 1734. Se inventaría en el Palacio del Buen Retiro en 1746, y con posterioridad en el Palacio Real Nuevo antes de su ingreso en el Museo del Prado en 1827.