Cuando Tiziano y Carlos se reunieron en Augsburgo en enero de 1548, el pintor le entregó una Venus perdida y este Ecce-Homo. No sabemos cuándo se enfrentó por primera vez Tiziano a esta iconografía, aunque probablemente fuera en 1535, cuando pintó para Federico Gonzaga un Cristo para el que se le proporcionó el modelo. El primer Ecce-Homo conservado es el de Carlos V y en él se aprecia un esfuerzo por alejarse del carácter icónico habitual de estas imágenes, frontales y circunscritas al busto, al mostrar a Cristo angulado y de tres cuartos, combinando el dramatismo inherente al tema, perceptible en los azotes y la sangre, con la serenidad de quien acepta su trágico destino.

Este tratamiento del Ecce-Homo gozó de gran fortuna, bien como figura aislada o en un contexto narrativo, en presencia de Poncio Pilato y sufriendo escarnio de los sayones. Tiziano regaló a Paulo III un Ecce-Homo en 1546 y otro al Aretino en enero de 1548, pronto copiado por Domenico Molino, y consta igualmente la réplica ese año para Granvela de un Ecce-Homo, muy similar al de Roma.

La crítica insiste en el carácter devocional de la obra, a menudo considerada un ejemplo de la adecuación de Tiziano al ideario contrarreformista. La empatía que suscitaba la imagen era evidente, como señaló Pietro Aretino a propósito de su Ecce-Homo, acaso el conservado en el Musée Condé de Chantilly, sólo distinto a éste por sostener la caña con la mano derecha. Tras calificar de devota la imagen, que guardaba en su dormitorio, añadía: El dolor en el que se debate la figura de Cristo, mueve al arrepentimiento a cualquiera que cristianamente mire sus brazos heridos por la cuerda que le ata las manos; aprende a ser humilde quien contempla el misérrimo hecho de la caña que sostiene en la diestra. Este tono pietista era el buscado por Carlos, lo que explica su satisfacción con el Ecce-Homo, que llevó a Yuste emparejándolo con una perdida Dolorosa de Michiel Coxcie, y del que en 1555 había pedido copia en pizarra a Jan Cornelisz. Vermeyen para la capilla del palacio de Coudenbergh en Bruselas.

Desconocemos cuándo se pintó este Ecce-Homo, pero probablemente fuera en Roma en paralelo al de Paulo III. Dos circunstancias avalan esta hipótesis: el monumental tratamiento de la anatomía, de inspiración miguelangelesca, y que sea la única obra de su autor sobre pizarra. Aunque consta el interés de Carlos V por un soporte pétreo, Tiziano debió conocer en Roma el empleo dado a la pizarra para obras de devoción por Sebastiano del Piombo, y su éxito entre miembros de la corte imperial como Francisco de los Cobos o el Conde de Cifuentes.

Felipe II emparejó este Ecce-Homo con la Dolorosa con las manos abiertas (P444) en su aposento del Alcázar de Madrid, edificio que no abandonó hasta el incendio de 1734 a excepción de un fugaz paso por el Palacio del Pardo. A dicho incendio probablemente se deba la abrasión de la pintura, también perceptible, aunque en menor medida, en su pareja. Posteriormente pasó al Palacio Real Nuevo e ingresó en el Museo del Prado en 1821.