El asunto está tomado de La leyenda dorada de Jacobo de la Vorágine (siglo XIII), donde se narra el viaje de san Antonio Abad para visitar a san Pablo, el primer ermitaño cristiano (siglo IV), en el desierto de Egipto. San Antonio, a quien Velázquez presenta vistiendo el hábito marrón con capa negra de los hospitalarios de San Antonio, aparece cinco veces en el cuadro: a lo lejos se le ve preguntando el camino a un centauro y también en conversación con un sátiro. Por una oquedad de la peña, que recuerda la gran formación rocosa del Paisaje con San Jerónimo de Patinir (ya entonces en la colección real y ahora en el Prado), le vemos llamar a la puerta del santo anacoreta. En el primer término conversan los dos, y Antonio manifiesta su sorpresa a la visita del cuervo que cada día trae a san Pablo su ración de pan. El último episodio de la historia se muestra a la izquierda, donde Antonio ha vuelto al enterarse de la muerte de Pablo y encuentra a dos leones cavándole la tumba.

Velázquez basó su representación del encuentro de los dos santos en el grabado de Durero sobre el mismo tema, aunque también tuvo que conocer la pintura de Sánchez Coello para uno de los altares de la basílica del Escorial. Diego Angulo (1946), señalando posibles fuentes visuales de la obra, no dejó de reconocer que la amplitud del escenario y la clara luz azul del valle, que recuerda el paisaje del norte de Madrid, eran una aportación singular de Velázquez. Más recientemente (Brown) se han trazado paralelos con frescos de paisajes romanos como los de Pietro da Cortona en la Villa Sacchetti de Castelfusano, que Velázquez pudo ver en 1630-1631. La aplicación de la pintura en una capa muy fina sobre una base de color claro logra efectos notables de luminosidad y translucidez. Se distinguen a simple vista varios pentimenti, por ejemplo en la figura de san Pablo y en el báculo de san Antonio. Originalmente la obra remataba en arco de medio punto (los dos ángulos superiores se añadieron y pintaron al entelarse el lienzo, quizá en el siglo XIX), lo que indica que fue concebida para un altar. Es probable que fuera encargada para la ermita de San Pablo, una de las ermitas construidas en los jardines del palacio del Buen Retiro, cuyo retablo, que incluía una escultura de San Pablo ermitaño del italiano Giovanni Antonio Ceroni, se terminó en mayo de 1633 (perdido). Documentada por primera vez en la ermita de San Antonio de los Portugueses en 1701, es posible que fuera trasladada allí cuando se reformó y redecoró la de San Pablo, entre 1659 y 1661.